Dokument: Untersuchungen zur Bedeutung verschiedener Enzyme des Glycin-Stoffwechsels für die Riboflavin-Bildung in Ashbya gossypii

Titel:	Untersuchungen zur Bedeutung verschiedener Enzyme des Glycin-Stoffwechsels für die Riboflavin-Bildung in Ashbya gossypii
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2656
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20031113-000656-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schlüpen, Christina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,00 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Stahmann, Klaus-Peter [Gutachter] Prof. Dr. Kölling-Paternoga, Ralf [Gutachter] Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter]
Stichwörter:	Ashbya gossypii, Riboflavin-Produktion, Pilz, Serin-Hydroxymethyltransferase, Glycin-Biosynthese, Aspartatkinase, Threonin-Biosynthese, C1-Stoffwechsel, Saccharomyces cerevisiaeAshbya gossypii, riboflavin overproduction, fungi, serine hydroxymethyltransferase, glycine biosynthesis, aspartate kinase, threonine biosynthesis, C1 metabolism, Saccharomyces cerevisiae
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der filamentöse Pilz Ashbya gossypii erhielt biotechnische Bedeutung durch seine Fähigkeit zur Überproduktion von Riboflavin (Vitamin B2). Glycin ist eine Vorstufe der de novo Purin-Synthese und fließt darüber in die Riboflavin-Biosynthese ein. Supplementierung des Mediums mit Glycin führt zu einer Steigerung der Riboflavin-Bildung. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der zwei an der Glycin-Biosynthese beteiligten Serin-Hydroxymethyltransferase (SHMT)-Isoenzyme, um eine verbesserte Glycin-Bereit-stellung für die Riboflavin-Produktion zu erreichen. Zur intrazellulären Lokalisierung der beiden SHMTs wurden HA-SHM-Fusionskonstrukte verwendet. Durch Immunodetektion wurde SHMT1 in den Mitochondrien und SHMT2 im Cytosol lokalisiert. Die Disruption von SHM2 resultierte in einer signifikanten Steigerung der Riboflavin-Überproduktion. Die spezifische SHMT-Aktivität fiel um 85 % von 3 mU/mg Protein auf 0,5 mU/mg Protein. Wurde zusätzlich SHM1 inaktiviert, konnten noch 3 % SHMT-Aktivität gemessen werden, die durch eine Nebenaktivität der Threonin-Aldolase zustande kam. Die erhöhte Riboflavin-Bildung der SHM2-Disruptanten konnte damit erklärt werden, dass der Fluss von Glycin zu Serin verringert wurde, was in einer verbesserten Verfügbarkeit der Riboflavin-Vorstufe Glycin resultierte. Wurde 13C1-Threonin gefüttert, fand sich mehr als 50 % der Markierung im C1 von Glycin, was durch die Threonin-Aldolase-Aktivität erklärt werden kann. Mehr als 30 % Markierung konnte im C1 von Serin bestimmt werden. Serin wurde aus Glycin durch die SHMT-Reaktion gebildet. Die Disruption von SHM1 hatte keinen detektierbaren Effekt auf die Markierung im Serin. Dagegen führte die Disruption von SHM2 zu einer erniedrigten Serin- (2 ? 5 %) und einer erhöhten Glycin- (59 ? 67 %) Markierung, was den veränderten Kohlenstofffluss zeigt. Die SHM2-Disruption führte zu einer reduzierten Wachstumsrate in Mineralsalzmedium. Supplementierung mit 1 mM Adenin stellte das Wildtyp-Wachstum wieder her, was zeigt, dass in Ag?SHM2 das Wachstum C1-limitiert ist. Da bei Überexpression des Gens für die Threonin-Aldolase nicht mehr Glycin, sondern Threonin limitierend für die Riboflavin-Synthese war, sollte die Threonin-Biosynthese in A. gossypii verbessert werden. Durch heterologe Komplementation einer Threonin-auxotrophen Mutante von Saccharomyces cerevisiae wurde das AgHOM3-Gen, das für eine monofunktionelle Aspartatkinase kodiert, isoliert. Im Rohextrakt von A. gossypii wurde eine spezifische Aspartatkinase-Aktivität von 5 mU/mg Protein gemessen. Die Zugabe von 10 mM Threonin inhibierte die Aktivität zu 85 %. Die Disruption des AgHOM3-Gens führte zu Homoserin-Auxotrophie. Die Riboflavin-Produktion von Ag?HOM3 war signifikant erhöht, wenn das Wachstum limitiert wurde. Wurde durch Supplementierung des Mediums mit Homoserin Wildtyp-ähnliches Wachstum wieder hergestellt, war die Produktion von Riboflavin niedriger als beim Wildtyp. Das läßt eine verstärkte Induktion der RIB-Gene als Ursache für die erhöhte Riboflavin-Produktion von Ag?HOM3 vermuten. The filamentous fungus Ashbya gossypii is an important riboflavin (vitamin B2) overproducer used in industrial scale. Productivity of the fungus is limited by glycine, a precursor of the de novo purine biosynthesis. Supplementation of the medium with glycine leads to an increase in riboflavin production. The first objective of this thesis was the characterization of the two serine hydroxymethyltransferase (SHMT) isoenzymes, which are involved in glycine metabolism, in order to improve the glycine supply for the riboflavin production. For a subcellular localization of both SHMT isoenzymes mutants transformed with HA-fusions were used. By immunodetection SHMT1 was localized in the mitochondria and SHMT2 in the cytosol. Disruption of SHM2 resulted in a significant increase of riboflavin overproduction. The SHMT specific activity decreased about 85 % from 3 mU/mg protein to 0.5 mU/mg protein. After additional inactivation of SHM1 a remaining SHMT activity of 3 % was detected, which was shown to be a side activity of threonine aldolase. The enhanced riboflavin overproduction of SHM2 disruptants was explained by a reduced flux from glycine to serine thus leading to an elevated pool of the riboflavin precursor glycine. Evidence was obtained by 13C-labeling experiments. When 13C1-threonine was fed, more than 50 % of the label was detected in C1 of glycine, resulting from threonine aldolase activity. More than 30 % labeling determined in C1 of serine could be explained by a serine synthesis via SHMT. Knockout of SHM1 had no detectable effect on serine labeling but disruption of SHM2 led to a decrease in serine (2 ? 5 %) and an increase in glycine (59 ? 67 %) labeling in position C1. These data indicate the modified carbon flux. Disruption of SHM2 led to a reduced growth rate in minimal medium. Supplementation with 1 mM adenine restored wild-type growth, which showed that growth of Ag?SHM2 is one-carbon limited. Since overexpression of the threonine aldolase gene had been shown to replace glycine by threonine limitation of riboflavin synthesis, the second objective of this thesis was a deregulation of threonine biosynthesis in A. gossypii. By heterologous complementation of a Saccharomyces cerevisiae mutant showing threonine auxotrophy the AgHOM3 gene encoding a monofunctional aspartate kinase was rescued. In crude extracts of A. gossypii an aspartate kinase specific activity of 5 mU/mg protein was detected. A mutant disrupted in HOM3 lost this enzyme activity and showed homoserine auxotrophy. The riboflavin production of Ag?HOM3 was significantly increased, when the growth was homoserine limited. Supplementation of the medium with homoserine restored wild-type growth but at the same time reduced production of riboflavin below wild-type level. Presumably an enhanced induction of the RIB genes was the reason for the increased riboflavin production of Ag?HOM3 .
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	13.11.2003
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	17.07.2003
Datum der Promotion:	17.07.2003