Dokument: Funktionelle Untersuchungen zur Wechselwirkung des archaebakteriellen Photorezeptors NpSRII mit seinem Transducer NpHtrII durch heterologe Expression in E.coli

Titel:	Funktionelle Untersuchungen zur Wechselwirkung des archaebakteriellen Photorezeptors NpSRII mit seinem Transducer NpHtrII durch heterologe Expression in E.coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2583
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20030727-000583-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mreyen, Silke [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,26 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] Prof. Dr. Büldt, Georg [Gutachter] PD Dr. Engelhard, Martin [Gutachter]
Stichwörter:	sensorisches Rhodopsin, E. coli, Archaebakterien, Chemotaxis, Phototaxis, Fusionsprotein, ITC, Retinal, Transducer, NpSRII
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Das sensorische Rhodopsin II (NpSRII) vermittelt im Komplex mit seinem Transducer (NpHtrII) die photophobe Reaktion des Archaebakteriums Natronobakterium pharaonis auf blau-grünes Licht. Dabei verursacht ein eintreffender Lichtreiz eine Konformationsänderung des sensorischen Rhodopsins II. Dieses Signal wird an den Transducer weitergeleitet, der daraufhin eine, der eubakteriellen Chemotaxis analoge, Signal-Transduktionskaskade aktiviert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rezeptor-Bindungsdomäne des Transducers charakterisiert und ein Modellsystem der archaebakteriellen Phototaxis in dem Eubakterium E. coli entwickelt werden. Zur Charakterisierung der Rezeptor-Bindungsdomäne des Transducers wurden vier verkürzte Transducer-Varianten heterolog in E. coli exprimiert und präparativ dargestellt. Die Bindung dieser Transducer-Varianten an das sensorische Rhodopsin II wurde durch gelelektrophoretische und kalorimetrische Experimente näher untersucht. Durch Isotherme-Titrations-Kalorimetrie konnten die Assoziationskonstanten und die Enthalpie-Werte der Komplexbildung ermittelt werden. Es wurde gezeigt, dass eine verkürzte Transducer-Variante, die die Aminosäuren (AS) 1?114 trägt, mit einer Assoziationskonstanten von 4,2 ? 106 M-1 und einem Enthalpie-Wert von -17,6 kJ/mol, eine den längeren Transducer-Varianten entsprechende Bindung an das sensorische Rhodopsin II vermittelt. Die Affinität beider Proteine zueinander erwies sich in weiteren Untersuchungen als unabhängig von der umgebenden Ionenstärke oder dem pH-Wert. Eine weitere Verkürzung des Transducers auf 101 Aminosäuren führte mit einer Assoziationskonstanten von 0,1 ? 106 M-1 zu einer erheblich schwächeren Bindung, die völlig zerstört wurde, wenn das Protein bis auf seine beiden transmembranen Helizes verkürzt wurde (AS 1-82). Zur weiteren Charakterisierung der Rezeptor-Bindungsdomäne des Transducers wurden Mutationen in die transmembranen Bereichen des sensorischen Rhodopsins II und des Transducers eingeführt und die Komplexbildung kalorimetrisch analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass eine fehlende Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Tyrosin in Position 199 (Y199) des Rezeptors und dem Asparagin in Position 74 des Transducers die Komplexbildung nicht beeinflusst, während die aromatischen Ringsysteme der Aminosäuren Y199 des sensorischen Rhodopsins und F28 des Transducers essentiell sind. Aufgrund der erhaltenen Daten konnte ein Modell zur Rezeptor-Bindungsdomäne aufgestellt werden, bei dem neben der ermittelten essentiellen Rolle der transmembranen Domänen dem Peptid von Aminosäure 101-114 des Transducers eine wichtige Rolle in der Wechselwirkung mit der zytoplasmatischen Oberfläche des sensorischen Rhodopsins II zukommt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte, aufgrund der bestehenden Homologie der Komponenten der Phototaxis zu den Komponenten der Chemotaxis, die Phototaxis in E. coli etabliert werden. Angesichts der deutlichen Homologie der zytoplasmatischen Domänen des archaebakteriellen Transducers und des eubakteriellen Chemorezeptors MCP 2, wurden drei Fusionsproteine aus dem N-terminalen Teil des Transducers und dem C-terminalen Teil des Chemorezeptors konstruiert. Durch die erfolgreiche Koaufreinigung des sensorischen Rhodopsins und der Fusionsproteine konnte erstmals gezeigt werden, dass die Fusionsproteine in-vitro eine Bindung mit dem Rezeptor eingehen. Vorläufige Ergebnisse zeigten zudem, dass die Chimäre, bestehend aus dem archaebakteriellen Transducer von Aminosäure 1-123 und dem eubakteriellen Chemorezeptor von Aminosäure 254-553, bei einer Überexpression in E. coli eine photophobe Antwort auf blau-grünes Licht vermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass ein phototaktisches System in E. coli entwickelt werden kann, was die Möglichkeit eröffnet, die Signaltransduktion von Zwei-Komponenten-Systemen physiologisch und biophysikalisch zu untersuchen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	27.07.2003
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	16.07.2003
Datum der Promotion:	16.07.2003