Zusammenfassung

Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es, durch Transkriptom-Vergleiche von Valin- produzierenden Stämmen von Corynebacterium glutamicum mit dem Wildtyp potentielle neue Zielgene für die Verbesserung der Produzenten-Stämme zu finden. Ein Gen für ein putatives Transport-Protein, das bei dieser Analyse auffiel, wurde deletiert und überexprimiert, zeigte jedoch keinen Einfluss auf die Valin-Produktion.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden Untersuchungen zur Funktion und Regulation der Aconitase in C. glutamicum durchgeführt. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:

1. In C. glutamicum ist die Aktivität der Aconitase auf Kohlenstoffquellen wie Propionat, Citrat und Acetat 2,5- bis 4-fach höher als auf Glukose. Bei der Suche nach dem zugrunde liegenden Regulationsmechanismus wurde ein Transkriptionsregulator des TetR-Typs identifiziert und als AcnR bezeichnet. Das acnR -Gen liegt direkt stromabwärts des Aconitase-Gens acn . Die Deletion von acnR führte zu einer 5-fach erhöhten acn -mRNA-Konzentration und zu einer 5-fach erhöhten Aconitase-Aktivität. Dies legte die Vermutung nahe, dass es sich bei AcnR um einen Repressor der acn -Expression handelt. DNA-Chip-Analysen wiesen darauf hin, dass acn das einzige Zielgen von AcnR im C. glutamicum -Genom ist. Durch Primer-Extension-Analyse konnten zwei Transkriptions-startpunkte des acn -Gens 110 und 113 bp stromaufwärts des acn -Startcodons identifiziert werden.
2. Heterolog in E. coli überproduziertes und aufgereinigtes AcnR bildete ein Homodimer, dass die acn -Promotorregion vor DNase I-Verdau im Bereich von -11- bis -28 bezüglich des ersten Transkriptionsstarts schützte. Die genomische Organisation von acn und acnR ist in allen Corynebakterien und Mycobakterien mit bekannter Genomsequenz konserviert. Durch Vergleich der acn -Promotorregionen aus diesen Spezies mit der in C. glutamicum ermittelten Binderegion konnte ein putatives Konsensus-Bindemotiv für AcnR hergeleitet werden: CAGNACnnncGTACTG. Mutationen in diesem Motiv verhinderten die Bindung von AcnR an den acn -Promotor von C. glutamicum .
3. Durch DNA-Affinitätschromatographie mit der acn -Promotorregion konnte neben AcnR noch ein weiterer Transkriptionsregulator der Aconitase gefunden werden, nämlich RamA. Dieser Regulator konnte aus Acetat-gewachsenen C. glutamicum -Zellen angereichert werden. Aus Glukose-gewachsenen Zellen konnte RamA nicht angereichert werden. Vermutlich fungiert RamA bei Wachstum auf Acetat als Aktivator der acn -Expression.
4. Außer durch AcnR und RamA wird die acn -Expression auch durch den Eisen-Gehalt des Mediums reguliert, da die acn -mRNA-Konzentration bei Eisenmangel deutlich geringer war als bei Eisen-Überschuss. Es konnte ein Transkriptions-regulator der AraC/XylS-Familie identifiziert werden, der möglicherweise für die Eisen-abhängige Regulation der acn -Expression verantwortlich ist.
5. Ein C. glutamicum -Stamm mit deletiertem acn -Gen war bei Wachstum in Glukose-Minimalmedium Glutamat-auxotroph. Dies bestätigt, dass C. glutamicum nur ein einziges Aconitase-Gen besitzt.

Abstract

  In the first part of this thesis the influence of valine production on global gene expression in Corynebacterium glutamicum was analysed in order to find new target genes for producer strain improvement. To this end, the transcriptomes of strain pairs differing in their valine production capability were compared using DNA microarrays covering the entire set of C. glutamicum genes. A putative transporter gene whose mRNA level was increased by valine production was deleted and overexpressed. However, valine synthesis was unaffected in the resulting strains.

  In the second part of this thesis the genetic regulation of the aconitase of C. glutamicum was analyzed. The activity of this enzyme was found to be 2.5- to 4-fold higher in propionate-, citrate- or acetate-grown cells than on glucose-grown cells. This variation was shown to be due to transcriptional regulation. A gene ( acnR ) encoding a TetR-type transcriptional regulator was found to be encoded immediately downstream of the aconitase gene ( acn ) in C. glutamicum . Deletion of acnR led to a 5-fold increase of the acn -mRNA level and of aconitase activity, suggesting that AcnR functions as repressor of acn . DNA microarray analyses indicated that acn is the primary target gene of AcnR in the C. glutamicum genome. Primer extension analyses revealed two transcriptional start sites of acn 110 and 113 bp upstream of the acn start codon. Purified AcnR was shown to be a homodimer which binds to the acn promoter in the region from -11 to -28 relative to the distal transcription start site. AcnR thus presumably acts by interfering with the binding of RNA polymerase. The acn - acnR organisation is conserved in all corynebacteria and mycobacteria with known genome sequence and a putative AcnR consensus binding motif (CAGNACnnncGTACTG) was identified in the corresponding acn upstream regions. Mutations within this motif inhibited AcnR binding. Since the activities of citrate synthase and isocitrate dehydrogenase were previously reported not to be increased during growth on acetate, our data indicate that aconitase is a major control point of TCA cycle activity in C. glutamicum and they identify AcnR as the first transcriptional regulator of a TCA cycle gene in the Corynebacterianeae .

  DNA affinity chromatography with the acn promoter region allowed the identification of a second transcriptional regulator of the acn gene, i.e. the RamA protein. RamA was enriched from C. glutamicum cells cultivated on acetate and probably functions as an activator of acn expression during growth on acetate.

  Except through AcnR and RamA, acn expression was also regulated by the iron content of the medium. Iron limitation led to decreased acn mRNA levels. Preliminary studies identified a transcriptional regulator of the AraC/XylS family which might be involved in the iron-dependent regulation of acn expression.

  Deletion of the acn gene resulted in a C. glutamicum strain that was glutamate-auxotrophic during growth on glucose minimal medium, confirming that there is only a single aconitase gene present in the C. glutamicum genome.