Dokument: Untersuchungen zum Pathogenitätsmechanismus von Viroid-RNA
| Titel: | Untersuchungen zum Pathogenitätsmechanismus von Viroid-RNA | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2710 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20040121-000710-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Schmitz, Axel [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] Prof. Dr. Lisowsky, Thomas [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Viroid, miRNA, PCR Produkt Aufreinigung, Plasmid DNA Aufreinigung, Nucleolin, hyl1, prä-rRNA, Rubisco, Fibrillarin, PEG Fällungviroid, miRNA, PCR product purification, plasmid dna purification, nucleolin, hyl1, pre-rRNA, rubisco, fibrillarin, PEG precipitation | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Viroide sind kleine, nicht kodierende RNA-Moleküle, die in geeigneten Wirtspflanzen zu einem beachtlichen Titer vermehrt werden. Das Untersuchungsobjekt der vorliegenden Arbeit - das Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd) - akkumuliert dabei im Nukleolus des Zellkerns, ohne die meisten Wirte erkennbar zu schädigen. Die Tomatenvarietät Rutgers gehört zu den wenigen Pflanzen, die bei PSTVd-Befall deutliche Krankheitssymptome entwickeln. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei pflanzliche Proteine auf ihre Wechselwirkung mit der Viroid-RNA hin untersucht. Zum einen die RNA-bindende Proteinkinase PKR, für welche eine wichtige Funktion im Krankheitsverlauf angenommen wurde, zum anderen eines der abundantesten Proteine des Nukleolus - Nukleolin. Die Proteinkinase bindet demnach die Viroid-RNA erstaunlich gut, jedoch weist sie diese Affinität auch zu der zellulären 7S-RNA auf und unterscheidet auch nicht zwischen unterschiedlich pathogenen Varianten der PSTVd-RNA. Außerdem ist ihre Aktivität im Gegensatz zu der am Anfang stehenden Hypothese offensichtlich unabhängig von einer Viroidinfektion, sodaß eine ursächliche Bedeutung dieser Wechselwirkung für den Krankheitsverlauf unwahrscheinlich ist. Das Nukleolin wurde aufgrund der Überlegung ausgewählt, daß eine abundante Komponente des Nukleolus die Viroid-RNA fest bindet und so ihre Akkumulation in diesem hochaktiven Organell ohne schädigende Auswirkungen für die Pflanze erlaubt. Diesem Protein kommt eine entscheidende Rolle bei den ersten Schritten der ribosomalen RNA-Prozessierung zu. In dieser Arbeit gelang erstmals die rekombinante Expression von Nukleolin und in der Folge der Nachweis, daß dieses Protein auch in Pflanzen mehrere Bindestellen am Beginn der prä-rRNA und im Bereich der ersten Prozessierungsstelle dieses Moleküls aufzuweisen scheint. Seine Affinität zur Viroid-RNA ist im Vergleich zu diesen natürlichen Bindemotiven relativ gering, jedoch hoch genug, um rein rechnerisch bis zu 99 % der PSTVd-RNA im Nukleolus zu binden. Der Versuch, einen weiteren putativen Wechselwirkungspartner des Viroids - das RNA-bindende Protein HYL1 - aus der Tomate zu klonieren, führte zum Erhalt der partiellen Sequenz eines entsprechenden Homologs und zu dem Ergebnis, daß dieses Protein sich zwischen verschiedenen Pflanzen auf hochinteressante Weise unterscheidet. Außerdem wurden im Verlaufe der Arbeit verschiedene PSTVd-Stämme in unterschiedlichen Pflanzen über relativ große Zeiträume kultiviert. Ihre Sequenzierung führte schließlich neben der Entdeckung verschiedener neuer Sequenzvarianten zu dem Ergebnis, daß eine bislang gültige Theorie, wonach steigende Pathogenität der Viroid-RNA mit einer zunehmenden Krümmung des Moleküls einhergeht, hinfällig ist. Stattdessen offenbarten in silico-Sequenzvergleiche, daß der pathogenitätsdeterminierende Abschnitt der PSTVd-RNA komplementär zu Abschnitten verschiedener mRNAs ist und insofern als Interfering-RNA wirken könnte, die den Abbau der betroffenen mRNAs determiniert oder ihre Translation unterdrückt.Viroids are small, noncoding RNAs which are replicated to a remarkable concentration in suitable host plants. Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd) is the object of study in the present work. It accumulates in the nucleolus of plant cells without harming most host plants. The tomato cultivar Rutgers is one of the few hosts developing symptoms upon PSTVd infection. The interaction of two plant proteins with the viroid-RNA was investigated in the present study: the RNA-binding protein kinase PKR, which had been assumed to play a role in pathogenicity, and Nucleolin, one of the most abundant proteins of the nucleolus. In the case of PKR, a remarkable affinity for viroid-RNA could indeed be found. This high affinity was identical, however, when PSTVd strains of varying pathogenicity or even the cellular 7S-RNA were tested. Moreover, the phosphorylation status of PKR in protein extracts of healthy and viroid-infected plants was found to be identical. This result contradicts previous findings by others and suggests that this enzyme does not play a central role in the pathogenicity process. The idea for studying nucleolin was that an abundant component of the nucleolus might sequester the viroid-RNA through tight binding, thus allowing its accumulation in this highly active organelle without interfering with the plant metabolism. This protein fulfills essential roles in the first steps of ribosomal RNA processing. In the present study, nucleolin could be produced recombinantely for the first time and the existence of multiple binding sites for this protein at the 5´end of Arabidopsis pre-rRNA and in the region surrounding the first processing site could be demonstrated. Its affinity for viroid-RNA is comparably low but high enough to bind up to 99 % of the RNA in the nucleolus by way of calculation. Trials to clone the RNA-binding protein HYL1 as another putative binding partner of PSTVd led to the discovery of a homolog of this protein in tomato and revealed that the corresponding proteins from different plant species vary in a highly interesting way.In the course of the present study, several strains of PSTVd were propagated in different host plants for relatively long periods of time. Sequencing of the viroid progeny resulted in the discovery of several hitherto unknown variants and revealed that a so far valid theory correlating pathogenicity of the RNA with bending of its virulence modulating region (VM-region) is wrong. Comparing the sequence of PSTVd to plant EST-data in silico instead showed that the upper part of the virulence modulating region is complementary to stretches of various mRNAs. It might therefore act as an interfering RNA, mediating the degradation of these mRNAs or hindering their translation. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 21.01.2004 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 18.12.2003 | |||||||
| Datum der Promotion: | 18.12.2003 |
