Dokument: On the influence of feedstock properties and composition on process development of expanded bed adsorption
(Einfluss der Eigenschaften und Zusammensetzung biotechnologischer Rohlösungen auf die Prozessentwicklung im Rahmen der Fließbettadsorption)

Titel:	On the influence of feedstock properties and composition on process development of expanded bed adsorption (Einfluss der Eigenschaften und Zusammensetzung biotechnologischer Rohlösungen auf die Prozessentwicklung im Rahmen der Fließbettadsorption)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2554
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20030706-000554-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Brixius, Peter Jochen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,52 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Kula, Maria-Regina [Gutachter] Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter]
Stichwörter:	Fließbettadsorption, Protein, Aufarbeitung, Zellaufschluss, Partikelgrößenverteilung, Insulin, WachstumshormonExpanded bed adsorption, protein purification, cell disruption, particle size, Insulin, human growth hormone
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	In den letzten Jahren hat sich die Fliessbettadsorption (EBA) zu einer etablierten Methode in der Aufarbeitung biologischer Produkte entwickelt. Unter Ausbildung eines perfekt klassierten Fließbettes (auch Expanded Bed Adsorption oder kurz EBA genannt) ist eine adsorptive Aufreinigung biotechnologischer Produkte direkt aus feststoffbelasteten Rohlösungen, wie z.B. Zellsuspensionen oder Zellhomogenaten, möglich (Thömmes, 1997). Mit der Einführung von Feststoffen in das System wird diese Art der Chromatographie deutlich komplexer im Vergleich zur Festbettchromatographie. Die eingebrachten Feststoffe (Zellen, Zelltrümmer,?) können während der Applikation mit dem Adsorber wechselwirken, wodurch es zur Ausbildung von Biomasse/Adsorber Aggregaten kommen kann. Dies wiederum führt zu nicht durchströmten Totzonen, Kanalbildung und kann im Extremfall zum vollständigen Zusammenbruch des Fließbettes führen (Feuser et al., 1999, Fernández-Lahore et al., 1999, Fernández-Lahore et al., 2000). Derartige Probleme sind in der Literatur hauptsächlich für Anioneaustausch Chromatographie beschrieben (Draeger and Chase, 1991, Fernández-Lahore et al., 1999, Fernández-Lahore et al., 2000, Feuser et al., 1999, Lin et al., 2001) ? welche häufig für die ersten Isolierungsschritte eingesetzt wird. Wie bereits von Lin et al (2003) gezeigt kann hier insbesondere von elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Biomasse und Adsorber ausgegangen werden. Aufgrund der kommerziellen Bedeutung intrazellulär expremierter Proteine beschäftigt sich der erste Teil dieser Arbeit hauptsächlich mit der Biomasse/Adsorber Interaktion während der Anionenaustausch Chromatographie beim Einsatz verschiedener Zellhomogenate. Bei Vergleich von Escherichia coli Homogenaten resultierend aus verschiedenen Standard Aufschlusstechniken zeigten sich deutliche Unterschiede im Hinblick auf die Viskosität, die Partikelgrößenverteilung der Zelltrümmer und der netto Oberflächenladung. Alle drei Parameter nahmen in folgender Reinenfolge Kugelmühle > Ultraschall > French Press signifikant ab. Die Viskosität kann hierbei direkt mit der Molekulargewichtsverteilung der DNA korreliert werden. Proben höherer Viskosität enthalten mehr hochmolekulare DNA als Proben niedriger Viskosität. In gleicher Reihenfolge konnte auch eine Zunahme der Zell Transmission (CTI, ein Maß für die Stärke der Biomasse/Adsorber Interaktion, hohe CTI Werte Þ niedrige Biomasse Interaktion) im Fließbett festgestellt werden. Die Zunahme des CTI konnte bei weiterführenden Untersuchungen verschiedener French Press Homogenate direkt mit der Abnahme der mittleren Partikelgrößenverteilung korreliert werden. Die mittlere Partikelgrößenverteilung der Zelltrümmer ist wiederum eine direkte Funktion der Anzahl der Aufschluss Zyklen und des verwendeten Druckes, bis ein Minimum erreicht ist. Gleiches gilt für die Oberflächenladung. Mit kleiner werdenden Partikeln nimmt auch die netto Oberflächenladung der Zelltrümmer ab. Für Gram- Bakterien wie Escherichia coli kann dies durch die asymmetrische Zellwandstruktur erklärt werden. Die negative Oberflächenladung ganzer Zellen resultiert hauptsächlich aus der stark negativ geladenen Lipopolysaccharidschicht der äußeren Zellmembran. Nach Zellaufschluss gewinnt die neutrale innere Zellmembran an Bedeutung für die Gesamtladung der Zelltrümmer, wodurch die Nettoladung abnimmt. Ferner konnte gezeigt werden, dass zur mechanistischen Erklärung der Biomasse Interaktion auf theoretische Grundlagen der Tiefenfiltration zurückgegriffen werden kann. Versteht man ein Fließbett als einen höchst ineffizienten Tiefenfilter mit vergrößertem Zwischenkornvolumen so kann die Biomasse/Adsorber Wechselwirkung auf zwei grundlegende Mechanismen zurückgeführt werden. Zum einen den Transport des Biomassepartikels zur Adsorber Oberfläche und zum zweiten die Adsorption am Adsorber. Der Sperreffekt kann für die Bedingungen wie sie im Fließbett vorliegen als grundlegender Transportmechanismus angesehen werden und für die Anionen Austausch Chromatographie kann man von elektrostatischen Wechselwirkungen als Adsorptionsmechanismus ausgehen. Für beide Mechanismen besteht eine direkte Abhängigkeit von der Partikelgröße wobei, die elektrostatische Wechselwirkung zusätzlich von der Oberflächenladung abhängt. Verringert man nun durch geeignete Aufschlussbedingungen sowohl die mittlere Partikelgrößenverteilung als auch die Nettoladung der Zelltrümmer kann damit die Biomasse Interaktion im Fließbett deutlich reduziert werden. Es konnte weiterhin eine lineare Korrelation zwischen einem Parameter (-zbzax) bestehend aus dem negativen Produkt der z-Potentiale von Zelltrümmer und Adsorber und dem CTI gezeigt werden. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Korrelation unabhängig von der verwendeten Biomasse (Saccharomyces cerevisiae oder E. coli) ist. Unter Verwendung dieses Parameters kann ausgehend von messbaren Parametern der Biomasse Suspension (Partikelgrößenverteilung und z-Potential) unter definierten Bedingungen (pH, Leitfähigkeit) auf die Biomasse/Adsorber Interaktion im Fließbett geschlossen werden. Mit einem optimierten Zellaufschluss können gegebenenfalls auch stark interagierende Systeme verarbeitet werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Entwicklungen zweier Aufarbeitungsprozesse gezeigt, die sich besonders mit der Optimierung des ersten Isolierungsschrittes beschäftigen. Für einen rekombinanten Insulin Precursor (MI3), expremiert in Saccharomyces cerevisiae, wurde ein effizienter Fließbettprozess entwickelt. Mittels Kationen Austauschchromatographie im Fließbett ist es nun möglich, den Insulin Precursor MI3 direkt aus dem Kulturüberstand zu isolieren. Somit gelang es insgesamt sechs Verfahrensschritte des bestehenden Aufarbeitungsprozesses (drei Zentrifugationsschritte, ein chromatographischer Schritt, eine Filtration und ein Kristallisationsschritt) in einen einzigen Fließbettschritt zu integrieren. Biomasse/Adsorber Interaktion war eines der Hauptprobleme beim Einsatz der Fließbettadsorption zur Aufarbeitung eines rekombinanten Precursor des menschlichen Wachstumshormons hGH aus Escherichia coli Homogenat, die vermutlich durch Optimierung der Aufschlussmethode hin zu kleineren Partikelgrößenverteilung und geringerer Nettoladung der Zelltrümmer minimiert werden kann. Als Alternative zur Fließbettadsorption wurden noch Verfahren wie Präzipitation mit anschließender Kationenaustausch Chromatographie und wässrigen Extraktion in Zweiphasen Systemen (ATPS) untersucht. Hierbei konnte mit der Kombination von ATPS und anschließender Ultrafiltration ein effizienter Prozess mit einer Gesamtausbeute über beide Schritte von 84 % entwickelt werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	06.07.2003
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	03.06.2003
Datum der Promotion:	03.06.2003